Alcance técnico de la microscopía confocal
La microscopía de barrido láser confocal, generalmente abreviada CLSM, se utiliza en la ciencia de los alimentos para ver cómo se distribuyen los componentes dentro de un producto sin depender únicamente de la apariencia de la superficie.Un microscopio confocal escanea un láser enfocado a través de la muestra y rechaza gran parte de la luz desenfocada con un orificio.El resultado es una sección óptica: un plano de imagen delgado dentro de una matriz alimentaria.Al recopilar múltiples planos, el analista puede crear una vista tridimensional de gotitas de grasa, redes de proteínas, gránulos de almidón, células de aire, cristales, fibras o dominios separados en fases.
Esto es valioso porque muchos defectos alimentarios son estructurales antes de que sean visibles.La formación de crema en una emulsión, la separación de fases en un gel, el desarrollo deficiente del gluten, la distribución de grasas en productos para untar, la agregación de proteínas en sistemas lácteos o partículas desiguales en matrices de cereales pueden explicar la textura, la estabilidad y la sensación en boca.Los estudios abiertos sobre la estructura de los alimentos muestran que CLSM puede observar grasas para untar, mayonesa, queso y masa, y trabajos más recientes extienden el método a la distribución cuantitativa de los componentes y el comportamiento de las fases.El método no es un adorno;es una forma de conectar la microestructura con el rendimiento del producto.
Mecanismo de microscopía confocal y variables del producto.
El principal desafío práctico es el contraste selectivo.Los alimentos contienen agua, grasas, proteínas, almidón, fibras, azúcares y, a veces, células vivas.El analista debe elegir tintes o fluorescencia natural que identifiquen la fase de interés sin mover el componente ni cambiar la estructura.El rojo del Nilo y colorantes relacionados se utilizan a menudo para los lípidos;las tinciones de proteínas fluorescentes pueden revelar redes de proteínas;Se puede utilizar yodo u otros métodos para el almidón, según la pregunta.El plan de tinción debe redactarse en torno al modo de falla.Si la cuestión es la coalescencia de las gotas de grasa, el contraste de lípidos es importante.Si la cuestión es la agregación de proteínas, el contraste de proteínas es importante.Si la pregunta es la distribución de las células de aire, la tinción puede ser menos importante que la geometría de la imagen.
El manejo de muestras puede crear artefactos.Cortar un gel blando puede manchar las gotas.Presionar una extensión debajo de un cubreobjetos puede cambiar el espaciado de las gotas.Secar una muestra puede colapsar los poros.El calentamiento durante la toma de imágenes puede cambiar los cristales de grasa o los geles de gelatina.El método debe utilizar una deformación mínima, una temperatura controlada y una edad de muestra coincidente.Las imágenes confocales son potentes sólo cuando la preparación de la muestra preserva la estructura que se investiga.
Evidencia de medición de microscopía confocal
El buen trabajo de CLSM no se limita a imágenes atractivas.La cuantificación puede incluir la distribución del tamaño de las gotas, el área de la proteína conectada, el tamaño de los poros, la fracción de volumen de la fase, el tamaño del grupo, el índice de coalescencia, el espesor de la pared celular o la distribución espacial de las inclusiones.Las imágenes tridimensionales son especialmente útiles cuando las imágenes bidimensionales tergiversan la conectividad.Una gota que parece aislada en un plano puede ser parte de un agregado más grande en otro plano.Por lo tanto, el análisis cuantitativo de imágenes necesita reglas de umbral, calibración, campos replicados y configuraciones de segmentación transparentes.
Para las emulsiones, las imágenes confocales pueden revelar mecanismos de floculación, coalescencia y formación de crema.Para los geles, puede mostrar si una red es fina y continua o gruesa y con fases separadas.Para productos horneados y cereales, puede ayudar a interpretar las células de aire, la distribución de proteínas y almidón y el colapso estructural.En el caso de los productos de origen vegetal, puede mostrar si la grasa, las proteínas y la fibra están dispersas o segregadas.Estas mediciones deben interpretarse con textura, reología, actividad del agua, tamaño de partículas o datos sensoriales;CLSM por sí solo no define la calidad.
Interpretación de fallos en microscopía confocal.
CLSM suele ser una herramienta de investigación o desarrollo, no una prueba de liberación de rutina para cada lote.Necesita preparación de muestras capacitada, acceso al microscopio y disciplina de análisis de imágenes.Úselo cuando las pruebas ordinarias no puedan explicar el defecto: una emulsión que pasa el tamaño de las partículas pero se vuelve cremosa durante el almacenamiento, un gel que tiene los sólidos correctos pero tiene una textura débil, una salsa que cambia de viscosidad después del tratamiento térmico o una capa que se ve correcta cuando está fresca pero florece más tarde.El informe final debe incluir imágenes objetivas, método de tinción, aumento, barras de escala, número de campos, reglas de análisis de imágenes y la conclusión práctica para la formulación o control del proceso.
Los estudios confocales más sólidos responden a una pregunta específica: ¿qué fase se movió, se agregó, se rompió, cristalizó o se conectó de manera diferente?Cuando la respuesta está ligada a variables de proceso, CLSM se convierte en una herramienta de decisión para el desarrollo de productos en lugar de una galería de micrografías.
Límites de control de cambios y liberación de microscopía confocal
En los sistemas lácteos, CLSM puede distinguir las gotas de grasa de las fases continuas ricas en proteínas y ayudar a explicar la formación de crema, la fractura del gel o la separación del suero.En los sistemas de panadería y cereales, puede mostrar hinchazón de los gránulos de almidón, continuidad de la red de proteínas y paredes de las células de aire.En emulsiones, puede mostrar si la inestabilidad es causada por floculación de gotas, coalescencia verdadera o separación de fases.En geles, puede revelar si la red es homogénea o está interrumpida por grandes poros y regiones separadas por fases.En análogos de la carne y alimentos ricos en proteínas, puede mostrar si las fases de proteína, grasa y fibra están alineadas, dispersas o segregadas.
El analista debería evitar exagerar.Una imagen confocal es una observación local.Los materiales alimentarios son heterogéneos, por lo que es esencial replicar campos y realizar muestreos representativos.Es posible que un hermoso campo seleccionado de una esquina de una muestra no represente el lote.Para comparaciones de procesos, obtenga imágenes de la misma ubicación anatómica o estructural, utilice el mismo método de aumento y umbral e informe la variabilidad en lugar de una sola imagen.
Revisión práctica de producción de microscopía confocal.
CLSM tiene límites en muestras muy opacas, muy dispersas o gruesas.La profundidad de penetración puede ser baja, la fluorescencia puede blanquear, los tintes pueden dividirse de manera imperfecta y la autofluorescencia puede confundir la interpretación.Algunas estructuras están por debajo del límite de resolución óptica.Los cristales de grasa, los pequeños agregados de proteínas o las gotas muy finas pueden requerir métodos complementarios como la microscopía óptica, la microscopía electrónica, el tamaño de partículas, la reología o la calorimetría diferencial de barrido.
El uso más fuerte es la triangulación.Si CLSM muestra una red de proteína gruesa, el análisis de textura debería mostrar la consecuencia.Si muestra coalescencia de la emulsión, las mediciones del tamaño de las partículas o de la formación de crema deberían respaldar la conclusión.Cuando la evidencia de la imagen y las mediciones del producto coinciden, el equipo de desarrollo puede ajustar con confianza las condiciones de homogeneización, hidratación, pH, tratamiento térmico, emulsionante o enfriamiento.
Preguntas frecuentes
¿Para qué se utiliza CLSM en la ciencia de los alimentos?
Representa la distribución interna de fases como gotas de grasa, redes de proteínas, gránulos de almidón, poros e inclusiones, a menudo para explicar defectos de textura o estabilidad.
¿Por qué es importante la tinción en la microscopía confocal de alimentos?
La tinción contrasta con la fase de interés;el tinte o la preparación incorrectos pueden ocultar el mecanismo o crear artefactos.
Fuentes
- Evaluación de la distribución y estructura de los componentes de los alimentos mediante microscopía de barrido láser confocal: una revisiónRevisión de acceso abierto utilizada para la distribución de componentes alimentarios y la cuantificación de la microestructura del CLSM.
- Cuantificación del comportamiento de la fase en compuestos alimentarios modelo mediante microscopía de barrido láser confocal 3DArtículo de acceso abierto utilizado para imágenes confocales 3D y medición de separación de fases.
- Microscopía láser de barrido confocal en la investigación de alimentos: algunas observacionesArtículo de acceso abierto sobre estructura alimentaria utilizado para la observación CLSM de productos para untar, mayonesa, queso y masa.
- Revisión: microscopía láser de barrido confocal.Una poderosa herramienta en la ciencia de los alimentos.Revisión de ciencias de los alimentos utilizada para el corte óptico, la preparación de muestras y la visualización de procesos.
- Imágenes cuantitativas de emulsiones agregadasArtículo científico utilizado para la segmentación de imágenes confocales y la cuantificación de agregación de emulsión.
- Matriz alimentaria: concepto central e investigaciones futuras.Revisión de acceso abierto utilizada para relacionar la microestructura con la funcionalidad de los alimentos y el contexto de la digestión.
- FDA - Guía para minimizar los riesgos microbianos para la seguridad alimentaria de las frutas y verduras recién cortadasSe agregó para alimentos con microscopía confocal porque esta fuente respalda la evidencia microbiana, de seguridad alimentaria, haccp y diversifica el conjunto de fuentes de artículos.
- Potenciales de los conservantes naturales para mejorar la seguridad alimentaria y la vida útil: una revisiónSe agregó para alimentos con microscopía confocal porque esta fuente respalda la evidencia microbiana, de seguridad alimentaria, haccp y diversifica el conjunto de fuentes de artículos.
- HACCP, gestión de calidad e inocuidad de los alimentos en sistemas alimentarios y agrícolasSe agregó para alimentos con microscopía confocal porque esta fuente respalda la evidencia microbiana, de seguridad alimentaria, haccp y diversifica el conjunto de fuentes de artículos.
- Bacterias del ácido láctico: aplicaciones para la seguridad alimentaria y la salud humanaSe agregó para alimentos con microscopía confocal porque esta fuente respalda la evidencia microbiana, de seguridad alimentaria, haccp y diversifica el conjunto de fuentes de artículos.